Przejdź do głównej treści

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Laboratorium spektroskopii w podczerwieni

Opis metody

Spektroskopia w zakresie podczerwieni (IR – Infrared Spectroscopy) jest od ponad siedemdziesięciu lat podstawową techniką wykorzystywaną do identyfikacji oraz badania struktury chemicznej i przestrzennej materiałów. Widmo w podczerwieni można uzyskać dla próbek w stanie stałym, ciekłym i gazowym. Pasma absorpcyjne widoczne w widmie IR związane są bezpośrednio z częstotliwościami drgań wiązań pomiędzy atomami, tworzącymi grupy funkcyjne w badanym materiale. Zgodnie z mechaniką kwantową częstotliwości te odpowiadają stanowi podstawowemu i kilku stanom wzbudzonym molekuły. Jednym ze sposobów na zwiększenie częstotliwości drgań molekularnych jest wzbudzenie odpowiedniego drgania poprzez pochłonięcie przez nie energii promieniowania elektromagnetycznego. Dla dowolnego przejścia między dwoma stanami energia ta musi dokładnie równać się różnicy energii między stanem podstawowym a pierwszym stanem wzbudzonym. Widmo w zakresie podczerwieni stanowi zatem zapis kolejnych intensywności absorpcji grup molekularnych w zależności od wartości energii promieniowania padającego na próbkę.

Można uznać, że widmo IR reprezentuje „odcisk palca” badanej próbki, ponieważ każdy materiał jest unikalną kombinacją atomów i żadne dwa różne związki nie dają dokładnie takiego samego widma w zakresie podczerwieni.

Widma w zakresie podczerwieni mikropęcherzyków pochodzących z moczu osób zdrowych (A) oraz pacjentów cierpiących na zaawansowaną cukrzycą typu II. Na rysunku przedstawione są średnie widma i odchylenia standardowe dla grupy kontrolnej ( 5 osób) i pacjentów ( 6 osób). Na widmach można zidentyfikować poszczególne składowe lipidów – hydrofilową głowę, region międzyfazowy i łańcuchy kwasów tłuszczowych. Pasma o najwyższej intensywności pochodzą od wiązania peptydowego białek. Są to Amid I i Amid II. Na rysunku wyróżnione są również pasma odpowiadające Amidowi III.

Aparatura

Laboratorium dysponuje spektrometrem FTIR ( Fourier Transform Infrared Spectroscopy) Nicolet 6700 firmy Thermo Scientific. Spektrometr przeznaczony jest do pomiaru widm w zakresie średniej podczerwieni (MIR, mid infrared). Zakres pomiarowy spektrometru obejmuje przedział od 4000 cm-1 do 400 cm-1 (2.5−25 μm). Nicolet 6700 umożliwia pomiary próbek stałych ciekłych i gazowych w trzech trybach pomiarowych: tradycyjne pomiary transmisyjne, pomiary wykorzystujące technikę osłabionego całkowitego odbicia ATR (Attenuated Total Reflectance) a także technikę dyfuzyjnego rozproszenia prmieniowania podczerwonego DRIFT (Diffuse Reflectance Infra-red Fourier Transform).

Do analizy wyników szeroko wykorzystujemy zaawansowane metody wielowymiarowej statystyki takie jak: Analizę Głównych Składowych (PCA Principal Component Analysis), Liniową Analizę Dyskryminacyjną (LDA Linear Discriminant Analysis) oraz Częściową Regresją Najmniejszych Kwadratów (PLS Partial Least Squares Regression)

Badania

Laboratorium Spektroskopii w Podczerwieni zajmuje się głównie badaniami mikropechęrzyków zewnątrzkomórkowych (z ang. extracellular vesicles; EVs) oraz ich potencjalnego zastosowania w diagnostyce medycznej i w dziedzinie nanomedycyny. Mikropęcherzyki są nośnikiem różnorodnego materiału biologicznego, w tym białek, lipidów, kwasów nukleinowych oraz metabolitów. Pęcherzyki posiadają charakterystyczną sygnaturę molekularną, która odzwierciedla ich pochodzenie, mogą zatem pełnić rolę biomarkerów chorób. (np. diagnostyka cukrzycy i jej powikłań). Obecnie w laboratorium wykonywane są pomiary próbek mikropęcherzyków pochodzących z hodowli komórkowych, płynów ustrojowych, jak również próbek lipidów i liposomów. Ponadto w pracowni wykonywane są badania, których celem jest określenie drugorzędowej struktury białek występujących w mikropęcherzykach.

Aktualnie realizowane tematy badawcze:

  • Zależność między składem molekularnym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych śródbłonka i beta trzustki a ich rolą w cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka - wpływ na właściwości błony komórek docelowych. W projekcie chcemy zbadać zawartość lipidów i białek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez hiperglikemiczne komórki śródbłonkowe i trzustkowe.

Rozkład drugiej pochodnej widm w zakresie Amidu I  na składowe drugorzędowej struktury białek. Na rysunku (a) przedstawione jest widmo ektosomów pochodzących od normoglikemicznych komórek śródbłonka a na rysunku (b) widmo ektosomów z komórek hiperglikemicznych.

  • Zmiany w składzie molekularnym subpopulacji mikropęcherzyków z linii komórkowych czerniaka o różnych stopniach złośliwości.

Procentowy udział drugorzędowych struktur białkowych w badanych liniach komórkowych oraz uwalnianych przez nie subpopulacji pęcherzyków. HEMa-LP - ludzkie melanocyty, WM115 – pierwotny czerniak skóry, WM266-4 – przerzutowy czerniak skóry. Na rysunku przedstawione są wyniki dla linii komórkowych oraz ekto i egzosomów [2].

  • Analiza spektralna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z moczu - poszukiwanie biomarkerów cukrzycy typu I oraz II oraz jej powikłań, w tym cukrzycowej choroby nerek.

Zależność VIP -Variable importance in projection od liczb falowych, na podstawie analizy PLS dla widm mikropęcherzyków pochodzących od pacjentów z różnym stopniem uszkodzenia nerek. Wartości VIP są miarą udziału każdej zmiennej (tutaj liczby falowej) w wariancji wyjaśnionej przez faktor PLS. Analiza VIP doskonale nadaje się do poszukiwania najbardziej istotnych pasm absorpcyjnych dla danego zbioru widm. W powyższym przykładzie są to głowa (kolor czerwony) i łańcuchy lipidowe (kolor zielony) oraz pasma Amidu I i II (kolor żółty).

  • Ocena jakości mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Widma ATR-FTIR ludzkich komórek śródbłonka z żyły pępowinowej (HUVEC) oraz uwalnianych przez nie mikropęcherzyków (EV). Rysunek przedstawia porównanie trzech metod ilolacji EV: wirowania różnicowego, filtracji w niskiej próżni oraz ultrawirowania. Jak widać filtracja jest najskuteczniejszą metodą wyodrębniania mikropęcherzyków [1].

Wybrane zrealizowane projekty:

  • Badanie tkanek objętych fizjologicznym lub patologicznym procesem mineralizacji. Badania obejmowały pomiary stopnia mineralizacji tkanek miękkich: płatków zastawek aortalnych oraz ścięgien żółtych kręgosłupa.

Trójwymiarowy model zmineralizowanego płatka zastawki aortalnej opracowany na podstawie pomiarów mikrotomograficznych (μCT) (a). Poprzeczny przekrój zwapnienia, wzdłuż czerwonej linii (b). Na rysunku zieloną elipsą zaznaczono silnie zwapniony depozyt. (c) Widm FTIR depozytu występującego w płatku zastawki aortalnej (zielona linia). W celu porównawczym przedstawiono również  widma tkanki kostnej, zębiny i szkliwa – tkanek fizjologicznie zmineralizowanych [4].

Wynik pomiaru μCT ścięgna żółtego kręgosłupa (a), zmineralizowany, pojedynczy depozyt mineralny (b) oraz jego przekrój (c). W badaniach, u większości pacjentów, dzięki zastosowaniu spektroskopii w zakresie podczerwieni, stwierdzono obecność hydroksyapatytu w depozytach wapniowych (d LF1). W kilku przypadkach w mineralizacjach dominował pirofosforan wapnia (d LF2) [6].

  • Skład chemiczny oraz morfologia kamieni nerkowych.

Trójwymiarowy obraz (na podstawie μCT) najczęściej występujących u pacjentów w Polsce kamieni szczawianowych (a), przekrój poprzeczny przez kamień (b) oraz widmo FTIR kamienia szczawianowego. Dla porównania na dolnym obrazie, kamień nerkowy, w którym dominuje hydroksyapatyt [3].

  • Funkcja wiązań krzyżowych w kolagenie kości beleczkowej.

Rozkład wiązań krzyżowych w rozgałęzieniu beleczek. Podczas formowania się tkanki kostnej najpierw pomiędzy włóknami kolagenu tworzą się wiązania krzyżowe DHLNL (dehydrodihydroksylysinonorleucine). Po pewnym czasie wiązania DHLNL przekształcają się w wiązania krzyżowe pyridynolinowe (PYR). Pierwsze z nich absorbują promieniowanie IR o liczbie falowej 1690 cm-1 a drugie 1660 cm-1. Na rysunku (a) przedstawiony jest rozkład ilości wiązań PYR a na rysunku (b) rozkład wiązań DHLNL. Rysunek (c) przedstawia stosunek ilości wiązań PYR/DHLNL. Bok kwadratów jest równy 0.25 mm.

Opublikowane artykuły

  1. Drożdż A, Kamińska A, Surman M, Gonet-Surówka A, Jach R, Huras H, et al. Low-vacuum filtration as an alternative extracellular vesicle concentration method: A comparison with ultracentrifugation and differential centrifugation. Pharmaceutics. 2020;12(9):1–17.
  2. E.Ł. Stępień, A. Kamińska, M. Surman, D. Karbowska, A. Wróbel, M. Przybyło. Fourier-Transform InfraRed (FT-IR) pectroscopy to show alterations in molecular composition of EV subpopulations from melanoma cell lines in different malignancy. Biochemistry and Biophysics Reports 25 (2021) 100888. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2020.100888
  3. A. Wróbel, E. Rokita, G. Taton, P. Thor. Chemical Composition and Morphology of Renal Stones. Folia Medica Cracoviensia. 2013 (3) 5–15.
  4. S. Orzechowska, A. Wróbel, G. Goncerz, P. Podolec, E. Rokita. Physicochemical and Micro-Tomographic Characterization of Inorganic Deposits Associated with Aortic Stenosis. The Journal of Heart Valve Disease 2014 (23) 40-47.
  5. Goncerz Grzegorz , Tomaszewski Krzysztof A. , Pasternak Artur , Głowacki Roman, Wróbel Andrzej , Rokita Eugeniusz , Podolec Piotr. A novel in-vitro model of human aortic valve mineralization. The Journal of Heart Valve Disease, 2014 (23) 545-549.
  6. S. Orzechowska, A. Wróbel, M. Kozieł, W. Łasocha, E. Rokita. Physicochemical characterization of mineral deposits in human ligamenta flava. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 2017, pp. 1-9; DOI 10.1007/s00774-017-0835-6.